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原位杂交试剂盒订制

发表时间:2019-11-26 10:50:22 关注:

原理

特异性的寡核苷酸探针,经地高辛标记。由于采用多相寡核苷酸探针和高敏感标记技术,并配合使用敏感性加强型的原位检测方法,具有敏感性特别高,背景清晰,结果准确可靠的优点。可以检测出常规福尔马林固定,石蜡包埋标本的特异mRNA序列。

靶基因的mRNA序列为:

15’—— ——3’

25’—— ——3’

试剂盒中内容:

1.胃蛋白酶(×10;Pepsin);

2.预杂交液;

3.地高辛标记寡核苷酸探针杂交液;

4.封闭液;

5.生物素化鼠抗地高辛;

6.SABC-POD

7.生物素化过氧化物酶。

准备工作:

1.固定液:4%多聚甲醛/0.1MPBSPH7.2-7.6);1%多聚甲醛/0.1MPBSPH7.2-7.6

2.3%柠檬酸,PH2.0左右。 2×SSC——1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g,柠檬酸三钠(C6H5O7Na3·2H2O,分子量2948.8g

0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml2×SSC即可。

0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。

20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。

原位杂交用PBS——0.02Mphosphate0.5MNaCl(1000ml蒸馏水加NaCl 30gNa2HPO4·12H2O 6g,NaH2PO4·2H2O 0.4g)PH7.2-7.6

操作步骤:

⒈培养细胞和冰冻切片

.冰冻切片:玻片须经防脱处理。冰冻切片厚度8-15μm

.细胞爬片:细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养,条件为375%CO2,所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1MPBS(PH7.4)2分钟×3次。

.培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定:固定液为4%多聚甲醛/0.1MPBSPH7.2-7.6),含有1/1000DEPC。室温固定20--30分钟。蒸馏水充分洗涤,干燥后-20冰冻可保存2周以上。

.30%H2O2 1+纯甲醇50份混合,室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。

.暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用PBS3×5分钟。蒸馏水洗1次。后接2-

二.石蜡切片:

.常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm

.石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。 蒸馏水洗3次。

.暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。

.后固定:胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1MPBSPH7.2-7.6),含有1/1000DEPC。室温固定10分钟。蒸馏水洗涤3次。

.预杂交:湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-422—4小时。吸取多余液体,不洗。

.杂交——按每张切片20μι杂交液,加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上。恒温箱38-42杂交过夜(根据杂交情况可以调节)

.杂交后洗涤:揭掉盖玻片,37左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次;370.5×SSC洗涤15分钟×1;370.2×SSC洗涤15分钟×1(如果有非特异性染色,重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2)

.滴加封闭液:3730分钟。甩去多余液体,不洗

.滴加生物素化鼠抗地高辛:3760分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。

⑽滴加SABC3720分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。

.滴加生物素化过氧化物酶:3720分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS5分钟×4次。

.DAB显色:使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂A,B,C各一滴,混匀,加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。

.必要时苏木素复染,充分水洗。

.酒精脱水,二甲苯透明,封片。

.显微镜下观察结果。

结果观察:mRNA的细胞胞浆着色呈棕黄色。

注意事项:

1. 应尽可能地采用新鲜标本,组织离体后最及时固定;

2.在固定液中加入0.1%DEPC处理,以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外,过度固定对原位杂交有明显的不利影响。

3.如果有少量的细胞核着色属于正常情况;如果出现大量的细胞核着色,往往和标本固定时间过长有关,应重新处理标本。

4.有明显的非特异性染色现象时,用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释,一般稀释2—10倍;并应加强探针杂交后的洗涤;

5.玻片均需经防脱处理。

使用仪器:OLYMPUS CX31光学显微镜

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