原理：

特异性的寡核苷酸探针，经地高辛标记。由于采用多相寡核苷酸探针和高敏感标记技术，并配合使用敏感性加强型的原位检测方法，具有敏感性特别高，背景清晰，结果准确可靠的优点。可以检测出常规福尔马林固定，石蜡包埋标本的特异mRNA序列。

靶基因的mRNA序列为：

（1）5’—— ——3’；

（2）5’—— ——3’；

试剂盒中内容：

1.胃蛋白酶（×10;Pepsin）；

2.预杂交液；

3.地高辛标记寡核苷酸探针杂交液；

4.封闭液;

5.生物素化鼠抗地高辛;

6.SABC-POD；

7.生物素化过氧化物酶。

准备工作：

1.固定液：4%多聚甲醛/0.1MPBS（PH7.2-7.6）；1%多聚甲醛/0.1MPBS（PH7.2-7.6）

2.3%柠檬酸，PH2.0左右。 2×SSC——1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠（C6H5O7Na3·2H2O，分子量294）8.8g。

0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml2×SSC即可。

0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。

20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。

原位杂交用PBS——0.02Mphosphate；0.5MNaCl(1000ml蒸馏水加NaCl 30g，Na2HPO4·12H2O 6g,NaH2PO4·2H2O 0.4g)，PH7.2-7.6。

操作步骤：

⒈培养细胞和冰冻切片

⑴.冰冻切片：玻片须经防脱处理。冰冻切片厚度8-15μm。

⑵.细胞爬片：细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO₂，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1MPBS(PH7.4)洗2分钟×3次。

⑶.培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1MPBS（PH7.2-7.6），含有1/1000DEPC。室温固定20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。

⑷.30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。

⑸.暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。后接2-

二．石蜡切片：

⑴.常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。

⑵.石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。 蒸馏水洗3次。

⑶.暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化3--30分钟（视标本新旧、厚薄自行调整）。

⑷.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1MPBS（PH7.2-7.6），含有1/1000DEPC。室温固定10分钟。蒸馏水洗涤3次。

⑸.预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。

⑹.杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。

⑺.杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次;37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。

⑻.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗

⑼.滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。

⑽滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。

⑾.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。

⑿.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。

⒀.必要时苏木素复染，充分水洗。

⒁.酒精脱水，二甲苯透明，封片。

⒂.显微镜下观察结果。

结果观察：mRNA的细胞胞浆着色呈棕黄色。

注意事项：

1. 应尽可能地采用新鲜标本，组织离体后最及时固定；

2.在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。

3.如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

4.有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤；

5.玻片均需经防脱处理。

使用仪器：OLYMPUS CX31光学显微镜

HHWZI.600 恒温水浴锅东方电工仪器厂